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利用活性污泥法處理工業(yè)廢水具有處理效果好、運(yùn)行管理方便等優(yōu)勢(shì)，通常認(rèn)為厭氧污泥微生物的正常生化處理應(yīng)滿足BOD5∶N∶P=（200~300）∶5∶1，但是隨著人類活動(dòng)的加劇，許多工業(yè)廢水（如釀造廢水）都存在磷元素缺乏的問(wèn)題。啤酒廢水作為常見(jiàn)的低磷特種廢水也面臨處理難度大的問(wèn)題。上流式厭氧污泥床反應(yīng)器（UASB）是目前較為常見(jiàn)的厭氧生物處理技術(shù)之一，被廣泛用于工業(yè)廢水的處理中。

為了探究低磷啤酒廢水厭氧處理階段的微生物種類及群落多樣性，筆者將本溪某啤酒廠的低磷特種廢水處理工藝中獲取的厭氧污泥接種于實(shí)驗(yàn)室UASB反應(yīng)器中，培養(yǎng)馴化直至運(yùn)行穩(wěn)定，對(duì)低磷厭氧污泥中的細(xì)菌和古細(xì)菌進(jìn)行高通量測(cè)序分析，以期為磷營(yíng)養(yǎng)源缺乏的厭氧生物處理機(jī)制及其技術(shù)改良提供參考。

1、材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

以本溪市某啤酒廠污水站厭氧罐中穩(wěn)定的厭氧污泥作為接種污泥，采用模擬啤酒廢水在實(shí)驗(yàn)室的UASB裝置中進(jìn)行馴化。UASB試驗(yàn)裝置的有效容積為1.96L，連續(xù)進(jìn)水，流量為15~25mL/min，溫度控制在30~40℃，放置在陰涼而且沒(méi)有陽(yáng)光直射的位置。

UASB裝置進(jìn)水為模擬低磷啤酒廢水，其COD、NH4+-N、TP濃度分別為1100~1500、20~24、3~3.2mg/L，pH為7.5~8.0，微量元素適量。

1.2 樣本的采集

厭氧污泥樣本取自啟動(dòng)后的耐低磷菌馴化UASB試驗(yàn)裝置。取反應(yīng)器上端（YJR1）和下端（YJR2）兩處污泥，充氮后存于0℃冰盒中，并快速轉(zhuǎn)移至-20℃超低溫冰箱至送檢。

1.3 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

1.3.1 DNA擴(kuò)增

對(duì)污泥樣本中的細(xì)菌和古細(xì)菌進(jìn)行高通量測(cè)序分析。針對(duì)污泥樣本中目標(biāo)基因組16SrDNA的V3及V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR模板為污泥樣本中提取的DNA原液，利用16SrDNA正反兩種引物即341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACH?VGGGTATCTAATCC）進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)PCR擴(kuò)增圖譜，擴(kuò)增后出現(xiàn)明顯清晰的條帶并且位置一致，證明PCR模板達(dá)到了擴(kuò)增的濃度要求。本試驗(yàn)委托上海生工生物公司對(duì)污泥樣本進(jìn)行IlluminaMiSeq高通量測(cè)序。

1.3.2 操作分類單元（OTU）分類

將所有樣本序列按照序列間的距離進(jìn)行聚類，然后根據(jù)序列之間的相似性分成不同的操作分類單元（OTU）。通過(guò)繪制OTU數(shù)量與聚類similarity值之間的關(guān)系圖，選出最佳的similarity值進(jìn)行OTU分析和分類學(xué)分析。通常取相似水平為97%的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)OTU列表中各樣本的物種豐度情況，應(yīng)用軟件mothur，計(jì)算種群豐富度指數(shù)即Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)，指數(shù)值越大，說(shuō)明群落豐富度越高；同時(shí)，計(jì)算群落多樣性指數(shù)即Shannon指數(shù)，Shannon指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。

2、結(jié)果與分析

2.1 UASB啟動(dòng)及耐低磷厭氧菌馴化

UASB系統(tǒng)從啟動(dòng)到穩(wěn)定，歷時(shí)約60d，分為3個(gè)階段：馴化期、提高負(fù)荷期、穩(wěn)定負(fù)荷期。啟動(dòng)階段COD濃度的變化如圖1所示。前10d為馴化期，在這期間COD去除率較低，有細(xì)小的分散污泥被洗出。經(jīng)過(guò)提高負(fù)荷期和穩(wěn)定負(fù)荷期，60d之后反應(yīng)器不再有絮狀污泥洗出，污泥呈顆粒狀，COD去除率穩(wěn)定在70%左右，基本符合啤酒廢水處理廠的COD去除狀態(tài)，證明UASB反應(yīng)器順利啟動(dòng)，馴化完成。

2.2 細(xì)菌分析

兩個(gè)污泥樣本的微生物豐富度和多樣性指數(shù)分析結(jié)果如表1所示?？芍?，樣本YJR2的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)都高于樣本YJR1，這說(shuō)明樣本YJR2的微生物菌群豐富度更高；此外，樣本YJR2的Shannon指數(shù)高于樣本YJR1，說(shuō)明樣本YJR2的微生物多樣性更高。

2.2.1 門水平的優(yōu)勢(shì)

菌群分布特征污泥樣本中細(xì)菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)分布如圖2所示。

由圖2可知，污泥樣本中細(xì)菌在門水平上具有較高的多樣性，達(dá)到35個(gè)門以上，取TOP10進(jìn)行分析。綠彎菌門（Chloroflexi）在樣本YJR1和YJR2中占比最大，分別為44.36%和46.57%，具有生物除磷功能，其在中低溫環(huán)境中迅速繁殖、在高溫環(huán)境中迅速衰亡；變形菌門（Proteobacteria）的占比為10.41%（YJR1）和14.95%（YJR2），具有一定的脫氮除磷能力，在地下水的微生物群落中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；綠菌門（Chlorobi）的占比為15.32%（YJR1）、10.54%（YJR2），其可進(jìn)行不產(chǎn)氧光合作用；廣古菌門（Euryarchaeota）的占比為11.62%（YJR1）和9.85%（YJR2），包含了古菌中的大多數(shù)種類，其中包括產(chǎn)甲烷菌；厚壁菌門（Firmicutes）的占比為5.96%（YJR1）和5.11%（YJR2），是腸道常見(jiàn)菌，包含好氧反硝化菌，與COD的降解去除有關(guān)；擬桿菌門（Bacteroidetes）為腸道常見(jiàn)菌，可水解纖維素等多糖物質(zhì)，具有硝化及反硝化除磷作用，占比為4.09%（YJR1）、4.47%（YJR2）；互養(yǎng)菌門（Synergistetes）的占比分別為1.52%（YJR1）和1.63%（YJR2），其可在厭氧消化反應(yīng)器中降解污泥產(chǎn)生沼氣；浮霉菌門（Planctomycetes）的占比為0.4%（YJR1）和0.48%（YJR2），是兼性厭氧菌，可利用糖類作為主要碳源，能夠降解有機(jī)物，參與氮循環(huán)；酸桿菌門（Acidobacteria）的占比分別為0.26%（YJR1）和0.51%（YJR2），大多為嗜酸菌，可降解纖維素等復(fù)雜有機(jī)物，是有益的腸內(nèi)菌；candidatedivision在兩個(gè)樣本中的占比均為0.25%，常見(jiàn)于活性污泥和雨林土壤中。

2.2.2 屬水平的優(yōu)勢(shì)菌群分布特征

污泥樣本中細(xì)菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)分布見(jiàn)圖3。污泥樣本中細(xì)菌在屬水平上具有較高的多樣性，達(dá)到270個(gè)屬以上。TOP10包括Chlorobium、Longilinea、Methanothrix、Levilinea、Acidovorax、Thauera、Acidaminobacter、Desulfomicrobium、Chlorobaculum、Aminivibrio。其中Chlorobium和Chlorobaculum屬于綠菌門（Chlorobi）；Longilinea、Levilinea屬于綠彎菌門（Chloroflexi）；Acidovorax、Acidaminobacter屬于厚壁菌門（Firmicutes）；Thauera、Desulfomicrobium屬于變形菌門（Proteobacteria）。

Chlorobium的占比分別為13.83%（YJR1）和9.88%（YJR2），硫細(xì)菌屬于該屬，具有厭氧光合產(chǎn)甲烷的功能特點(diǎn)；Longilinea的占比分別為10.11%（YJR1）和11.7%（YJR2），具有代謝多種碳水化合物、與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)時(shí)促進(jìn)其生長(zhǎng)的作用；Methanothrix屬于廣古菌門（Euryarchaeota），占比為11.52%（YJR1）和9.76%（YJR2），能夠?qū)⒁宜岱纸鉃镃H4和CO2；Levilinea占比為9.51%（YJR1）和4.44%（YJR2），能代謝多種碳水化合物生成有機(jī)酸；Acidovorax占比為5.47%（YJR1）和4.6%（YJR2），是兼性厭氧菌屬；Thauera占比為0.35%（YJR1）和2.83%（YJR2），為兼性反硝化菌，具有脫氮及合成內(nèi)碳源的功能；Acidaminobacter占比為1.05%（YJR1）和1.79%（YJR2），為專性厭氧菌，能代謝碳水化合物生成有機(jī)酸；Desulfomicrobium占比為0.15%（YJR1）和2.11%（YJR2），嚴(yán)格厭氧而且活性較強(qiáng)的硫酸鹽還原菌屬于該菌屬；Chlorobaculum占比為1.48%（YJR1）和0.66%（YJR2），是厭氧菌，可以還原硫化合物，利用光自養(yǎng)生長(zhǎng)；Aminivibrio屬于互養(yǎng)菌門（Synergistetes），占比為0.93%（YJR1）和0.98%（YJR2），是能發(fā)酵氨基酸和有機(jī)酸的厭氧細(xì)菌屬。

根據(jù)以上分析，可以歸納出污泥樣本中細(xì)菌的主要功能特點(diǎn)：可以分解代謝多種碳水化合物生成有機(jī)酸、硫以及硫酸鹽等。啤酒的主要生產(chǎn)原料是玉米和大麥，將玉米、大麥粉碎后加入啤酒花和鮮酵母對(duì)其進(jìn)行糖化處理、發(fā)酵，在此過(guò)程中產(chǎn)生的廢水主要有浸麥廢水、糖化和發(fā)酵廢液、糖化與發(fā)酵階段的洗滌廢水、冷卻水等。由于啤酒加工工藝的特殊性，其產(chǎn)生的廢水主要成分相比常規(guī)的厭氧廢水含有更多的糖類和蛋白質(zhì)，硫化物的含量也相對(duì)較高。

厭氧污泥在啤酒廢水的長(zhǎng)期馴化中，使得硫化細(xì)菌和硫酸鹽還原菌成為優(yōu)勢(shì)菌種。污泥樣本中的硫化細(xì)菌為第一優(yōu)勢(shì)菌屬（在樣本YJR1和YJR2中的占比分別為13.83%、9.88%），明顯高于普通厭氧污泥中與硫相關(guān)含量最高的菌屬（占比在1%左右）。樣本中TOP10的菌屬有一些與硫及硫酸鹽的氧化還原反應(yīng)有關(guān)，這可能是由于磷營(yíng)養(yǎng)源缺乏不能提供能量，從而利用硫及硫酸鹽的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生能量，供反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行。

2.2.3 物種差異比較

基于物種分類結(jié)果，計(jì)算在不同水平上各rank的豐度，比較樣本或組間豐度差異，找出樣本或組間豐度存在顯著差異的物種分類，默認(rèn)只做門和屬的水平，篩選條件為p≤0.05。當(dāng)比較對(duì)象為樣本時(shí)，采用fisherexacttest，將檢驗(yàn)得到的p值采用FDR做Multipletestcorrection得到q值。

在門水平上樣本YJR1與YJR2物種差異比較的誤差線見(jiàn)圖4。中間所示為95%置信度區(qū)間內(nèi)，物種分類豐度的差異比例，當(dāng)p<0.05時(shí)，表示差異顯著，物種分類用紅色標(biāo)識(shí)。由圖4可知，有10種菌門的p值小于0.05，其中Chloroflexi、Euryarchaeota、Proteobacteria、Chlorobi的豐度差異比較大，樣本YJR2中Chloroflexi的豐度較高，可能是因?yàn)槿游恢迷诜磻?yīng)器下端，厭氧條件充分，有利于代謝碳水化合物，另外，下端水浴循環(huán)溫度適宜也是原因之一。Proteobacteria的豐度與氧含量有關(guān)。YJR1樣本中Chlorobi豐度較高可能與頂端少量光照有關(guān)。厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是產(chǎn)甲烷過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌群，兩者的相互作用可提高厭氧消化過(guò)程的穩(wěn)定性，降低環(huán)境因素變化對(duì)消化過(guò)程的沖擊。

在屬水平上樣本YJR1與YJR2物種差異比較的誤差線見(jiàn)圖5。

圖5中列出的24種菌屬的p值均在0.05以下，其中Chlorobium、Longilinea、Methanothrix、Levilinea豐度差異較大。樣本YJR1中Chlorobium豐度較高與光照有關(guān)，Methanothrix豐度較高是由于反應(yīng)器下端主要完成厭氧消化中水解發(fā)酵階段，上端進(jìn)行嗜乙酸產(chǎn)甲烷階段。樣本YJR2中Longilinea豐度較高是由于下端進(jìn)污水，受到有機(jī)物沖擊較大，所以需要更多細(xì)菌水解發(fā)酵，促進(jìn)產(chǎn)甲烷菌增長(zhǎng)以更有利于降解大分子有機(jī)物。

2.2.4 功能豐度

通過(guò)分析已有測(cè)序微生物基因組的基因功能構(gòu)成及16SrDNA測(cè)序獲得的物種構(gòu)成等，推測(cè)樣本中基因功能的構(gòu)成。樣本YJR1的基因功能豐度見(jiàn)圖6。樣本YJR1所具有的功能主要為［R］（僅限一般功能預(yù)測(cè)）、［E］（氨基酸運(yùn)輸和代謝）、［G］（碳水化合物的運(yùn)輸和代謝）、［S］（功能不明）、［C］（能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換）、［M］（細(xì)胞壁/膜/包膜的生物生成）、［K］（轉(zhuǎn)錄）、［P］（無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸和代謝）、［J］（翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物生成）、［L］（復(fù)制、重組和修復(fù)）、［T］（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制）。其中，微生物功能預(yù)測(cè)，氨基酸運(yùn)輸和代謝，碳水化合物的運(yùn)輸和代謝，能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換，細(xì)胞壁/膜/包膜的生物生成，微生物的轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等功能作用顯著。

2.3 古細(xì)菌分析

2.3.1 門水平的優(yōu)勢(shì)菌群分布特征

樣本中古細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門水平上的多樣性較低，共檢出3個(gè)門：廣古菌門（Euryarchaeota）、泉古菌門（Crenarchaeota）、浮霉菌門（Planctomycetes）。其中，廣古菌門（Euryarchaeota）占比最高，為99.97%（YJR1）和99.9%（YJR2），產(chǎn)甲烷古菌屬于該菌門；泉古菌門（Crenarchaeota）占比較低，為0.03%（YJR1）和0.1%（YJR2），具有依賴硫的特點(diǎn)，可能是海洋環(huán)境中最豐富的古細(xì)菌；浮霉菌門（Planctomycetes）在兩個(gè)樣本中極其微量，占比幾乎為0，屬于兼性厭氧菌，能利用糖類作為主要碳源、降解有機(jī)物、參與氮循環(huán)。

2.3.2 屬水平的優(yōu)勢(shì)菌群分布特征

樣本中古細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上的多樣性也較低，共檢出14個(gè)屬，優(yōu)勢(shì)菌屬為Methanothrix、Methanobacterium。Methanothrix在兩個(gè)樣本中占比最高，為97.04%（YJR1）和97.44%（YJR2），可將乙酸分解為CH4和CO2；Methanobacterium的占比為2.26%（YJR1）和1.11%（YJR2），是不活動(dòng)的厭氧菌。它們普遍存在于一些炎熱、低氧的環(huán)境中。

2.3.3 物種差異比較

在門水平上樣本YJR1與YJR2中的古細(xì)菌物種差異并不明顯，這是由于污泥中的古細(xì)菌種類較少，主要是產(chǎn)甲烷古菌。廣古菌門（Euryarchaeota）中產(chǎn)甲烷古菌是能夠以乙酸、H2/CO2、甲基化合物等為原料生成甲烷的微生物。

3、結(jié)論

①UASB試驗(yàn)裝置啟動(dòng)成功歷時(shí)60d左右，COD去除率穩(wěn)定在70%左右，基本符合啤酒廢水處理廠COD的去除狀態(tài)。

②經(jīng)高通量測(cè)序分析，模擬低磷啤酒廢水UASB處理系統(tǒng)中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬為Chlorobium、Longilinea、Methanothrix、Levilinea等，它們的主要功能是分解代謝多種碳水化合物生成有機(jī)酸、硫及硫酸鹽等；古細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬主要為Methanothrix、Methanobacterium，它們的主要功能是以乙酸、H2/CO2、甲基化合物等為原料生成甲烷。

③污泥中細(xì)菌和古細(xì)菌的功能與啤酒廢水中的污染物有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明高通量測(cè)序有效。與其他常規(guī)厭氧污泥相比，處理模擬低磷啤酒廢水的厭氧污泥中硫化細(xì)菌和硫酸鹽還原菌含量較高，為優(yōu)勢(shì)菌種，它們能夠進(jìn)行氧化還原反應(yīng)為其他厭氧菌種提供能量，使反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定。