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好氧顆粒污泥（AGS）是廢水生物處理領(lǐng)域的一項新技術(shù)，是活性污泥絮體在一定條件下自凝聚，最終形成結(jié)構(gòu)致密、形狀規(guī)則的微生物聚合體。成熟的AGS呈球形或橢球形結(jié)構(gòu)，顏色多為橙黃色、棕色、灰褐色。與傳統(tǒng)的活性污泥相比，其具有良好的沉降性、較高的生物量和穩(wěn)定的處理效能，因而極具發(fā)展?jié)撡|(zhì)。

新疆是主要的番茄醬生產(chǎn)和加工基地，每年7月—10月中旬會產(chǎn)生大量的高濃度有機(jī)廢水，此類廢水超標(biāo)排放會對環(huán)境造成危害。而處理番茄醬這類季節(jié)性的食品加工廢水，需要提前馴化污泥以適應(yīng)每年的生產(chǎn)季。已有科研人員對在SBR中采用AGS處理番茄醬生產(chǎn)廢水的污泥顆?；^程進(jìn)行了分析，并積累了經(jīng)驗。另外，也有部分學(xué)者對AGS的儲存與恢復(fù)性能進(jìn)行了研究。高景峰等分析了AGS在不同儲存方法條件下的恢復(fù)效果及影響。但AGS在長期冷凍儲存后處理番茄醬廢水的性能恢復(fù)及微生物演替情況研究仍存在空白。

筆者對冷凍儲存260d左右的AGS進(jìn)行恢復(fù)試驗，探究污泥特性，并采用高通量測序技術(shù)表征恢復(fù)后的微生物群落，旨在尋求適應(yīng)番茄醬生產(chǎn)周期的合理化廢水處理方式，這對解決AGS長期馴化問題、與實際生產(chǎn)運用的對接和保護(hù)水資源具有現(xiàn)實意義。

1、材料與方法

1.1 試驗裝置和運行方式

SBR反應(yīng)器由有機(jī)玻璃制成，其內(nèi)徑為8cm，高為100cm，有效容積為4L。反應(yīng)器底部設(shè)有曝氣裝置，控制溶解氧（DO）在8mg/L左右，pH保持在7.0~7.5之間。一個運行周期為4h，每天運行6個周期，共進(jìn)行130d。其中，進(jìn)水10min、曝氣200min、初始沉降時間為28min、出水2min。

1.2 接種污泥

試驗接種污泥取自實驗室采用配制番茄醬廢水培養(yǎng)了185d的AGS，質(zhì)量為200g，MLSS為5750mg/L，MLVSS為4830mg/L，MLVSS/MLSS為0.84，在-18℃環(huán)境下于清水瓶中恒溫冷凍保存約260d。AGS外觀呈淺褐色球形或橢球形，結(jié)構(gòu)較為密實、光滑（見圖1），顆粒粒徑平均為8mm，最大可以達(dá)到11mm。

體視顯微鏡顯示，部分顆粒的表面存在孔洞，是為顆粒內(nèi)部傳遞營養(yǎng)物質(zhì)和輸送氣體的通道。在長期的低溫環(huán)境中儲存后，細(xì)菌凋亡，活細(xì)菌逐漸減少，生物活性降低，一些顆粒發(fā)生了破裂。

1.3 試驗水質(zhì)

試驗水質(zhì)采用人工合成的番茄醬加工廢水，以鮮榨番茄汁提供碳源，COD濃度為800~1400mg/L，NH4+-N、PO43--P分別由氯化銨（NH4Cl）和磷酸氫二鈉（Na2HPO4）配制，濃度分別為50、10mg/L。采用無水碳酸鈉（Na2CO3）調(diào)節(jié)pH。常量元素和微量元素的配制參照文獻(xiàn)。

1.4 分析項目及方法

COD、NH4+-N、PO43--P、MLSS、MLVSS和污泥容積指數(shù)（SVI）等采用《水和廢水監(jiān)測分析方法》（第4版）測定，DO采用溶解氧儀測定。

高通量測序：取適量不同時期的顆粒污泥分別放入已滅菌的2mL離心管中進(jìn)行提取，在0℃下保存。取4個時期的污泥樣品，分別編號為D1（65d污泥）、D2（90d污泥）、D3（120d小顆粒污泥，粒徑為0.45~2mm）、D4（120d大顆粒污泥，粒徑為3~4mm）。DNA提取和PCR引物擴(kuò)增均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，提取的具體過程參照E.Z.N.ATMMag-BindSoilDNAKit的基因組DNA提取試劑盒說明書。電泳條件為1%瓊脂糖凝膠、1×TAE的電泳緩沖液、110V的電壓、15min。擴(kuò)增片段為16SrDNA的V3-V4，片段大小為400bp左右。PCR引物為341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）。

2、結(jié)果與討論

2.1 活性恢復(fù)過程中污泥的物理特性

圖2為AGS活性恢復(fù)試驗不同時期的照片。

從圖2可以看出，培養(yǎng)第2天的AGS開始松散、解體，出現(xiàn)帶狀剝落層，出水渾濁，MLSS只有4330mg/L，MLVSS/MLSS為0.58。接種后第7天，MLSS達(dá)到5590mg/L，部分顆粒停止破裂，形態(tài)由松散向圓實轉(zhuǎn)化，顆粒表面變得光滑瑩潤、顏色加深、顆粒增多、粒徑縮小。到第13天時，MLSS降到4340mg/L，粒徑在4mm以上的顆粒污泥占34.7%，小于0.45mm的達(dá)到22.3%。當(dāng)?shù)?0天時，大顆粒污泥消失，基本為2~4mm的黃色扁平狀小顆粒，部分空洞，平均沉降速度提高到66.47m/h，出水水質(zhì)清澈。第35天再次發(fā)生變化，空洞的顆粒污泥解體消失，成長為密實的黃褐色橢球形污泥，粒徑在0.45~1mm之間、由絮狀污泥新生的小粒徑污泥質(zhì)量比過半，MLSS為5632mg/L。第100天時，粒徑為0.45~2mm的新生顆粒占到68%，大于4mm的顆粒質(zhì)量比不超過10%，MLSS穩(wěn)定在8000mg/L左右。最終，第130天時，0.45~4mm的粒徑占比超過75%，占主導(dǎo)地位。

分析原因，好氧顆粒污泥經(jīng)過長期低溫儲存后，死菌和活菌相互分離從顆粒中脫落。起初2d，一部分膠體溶于水中，增加了懸浮物濃度，而另一部分則解體分散，以晶核形式重新顆?；５降?天，出現(xiàn)大量的絮體污泥，說明新一代微生物已經(jīng)開始生長繁殖，出水水質(zhì)變好，預(yù)示著污泥活性開始恢復(fù)。緊接著通過縮短沉降時間來截留具有活性的污泥，致使MLSS降低。第35天開始，顆粒污泥結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，去除率高，微生物量豐富，已經(jīng)完全恢復(fù)了好氧顆粒污泥的良好性質(zhì)，標(biāo)志著顆?；瓿伞４撕?，第二代新生小顆粒污泥質(zhì)量比逐漸提高，系統(tǒng)運行趨于穩(wěn)定。

2.2 活性恢復(fù)過程中污染物的去除效果

在污泥活性恢復(fù)過程中對污染物的去除效果如圖3所示。

從圖3（a）可知，進(jìn)水COD為800~1400mg/L?；謴?fù)試驗第2天，進(jìn)、出水COD分別為1264.47、203.63mg/L，去除率為83.90%，達(dá)不到出水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。第6天時，去除率約為90%。后期即使進(jìn)水COD上下波動明顯，去除率仍然保持在90%以上，最高達(dá)98.7%，平均在95%，達(dá)到了冷凍儲存前的COD去除效果。說明好氧硝化細(xì)菌活性良好，已經(jīng)完全恢復(fù)了AGS的除污特性。絮狀污泥與顆粒污泥共存的兩相污泥沒有降低COD去除率。

從圖3（b）可知，進(jìn)水NH4+-N為42.12~62.46mg/L，出水水質(zhì)波動較大。第2~7天，出水NH4+-N平均為34.61mg/L，去除率只有34.67%，活性恢復(fù)才剛開始。隨后兩周，NH4+-N去除率持續(xù)上升。到第20~35天，出水NH4+-N平均濃度降到9.41mg/L，最低為3.11mg/L，去除率提高到80%以上，最高達(dá)到93%。但因為此時顆粒污泥的結(jié)構(gòu)并不完整，多為扁平狀，破壞了AGS的好氧-兼氧-厭氧空間結(jié)構(gòu)，缺乏厭氧菌，致使反硝化反應(yīng)不徹底。第35天后，顆粒結(jié)構(gòu)重新穩(wěn)定，空洞部分形成了厭氧區(qū)，NH4+-N去除效果變好。到了第60天后，縮短沉降時間至5min，大量污泥從系統(tǒng)流失。同時，此時進(jìn)入冬季，水溫在10~15℃之間，微生物活性受到抑制，絮狀污泥生長緩慢，顆粒污泥減少，使得NH4+-N去除效能下降。隨后為提高M(jìn)LSS，沉降時間調(diào)至25min，第90天之后，顆粒污泥逐漸恢復(fù)，穩(wěn)定后NH4+-N去除率在82%左右，但依舊不能恢復(fù)到90%以上，主要是受溫度的影響。

從圖3（c）可以看出，進(jìn)水PO43--P濃度約為11mg/L，出水PO43--P濃度最低為0.87mg/L，整體變化趨勢與NH4+-N相似。波動起伏后，去除率最終在第105天恢復(fù)到80%以上。

2.3 微生物群落高通量宏基因組測序分析

AGS內(nèi)部存在厭氧、兼氧、好氧復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，不同的區(qū)域能夠為各功能微生物提供適宜的生存條件。在硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌及異養(yǎng)菌共同作用下，可以實現(xiàn)同步脫氮除磷。因此，分析AGS的微生物群落、優(yōu)勢菌群有助于探究AGS活性恢復(fù)機(jī)理。為此，在研究冷凍顆粒污泥物理活性恢復(fù)和污染物去除效能的基礎(chǔ)上，通過高通量宏基因組測序手段，對活性恢復(fù)第65、90、120天的AGS樣品的16SrDNA的V3-V4進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得有效序列。

2.3.1 微生物的多樣性

使用相似性97%的操作分類單元（OTUs），利用Mothur軟件進(jìn)行稀釋性分析，微生物稀釋曲線如圖4所示。曲線光滑平整，說明檢測到的微生物信息量大且穩(wěn)定，4個樣品的曲線都趨于平坦，表明測序結(jié)果涵蓋了樣品中絕大多數(shù)微生物信息。

圖5為微生物群落的Venn圖。

從圖5可知，4個樣品的總OTUs數(shù)為13260個，共同重疊的為220個，占OTUs總數(shù)的1.66%，表明伴隨著顆?；^程，微生物群落組成發(fā)生了較大改變且存在一定的相似性。

當(dāng)達(dá)到飽和測序時，所獲得的物種最大數(shù)量由Chao1指數(shù)表征。顆粒污泥形成過程中，Chao1指數(shù)的排序為D1>D4>D3>D2，見表1，表明樣品豐富度不斷發(fā)生變化。D1時期物種豐富度較高，D2、D3階段物種豐富度降低，D4階段又得到恢復(fù)。

2.3.2 微生物群落在門水平上的差異

不同時期污泥樣品細(xì)菌在門水平上的分布情況如圖6所示?？芍?，在4個檢測樣本（D1~D4）中，細(xì)菌在門水平上分類數(shù)目分別為14、13、16、14。從4個樣品的檢測結(jié)果來看，無論在哪個階段，變形菌門（Proteobacteria）都占到細(xì)菌門類總數(shù)60%以上，擬桿菌門（Bacteroidetes）在各個階段的占比均在20%以上，可見Proteobacteria和Bacteroidetes為主要門類，對降解番茄醬生產(chǎn)廢水起著重要作用，這與陳啟偉等的結(jié)果一致。Proteobacteria由于涵蓋的菌株豐富和代謝途徑的多樣性，作為優(yōu)勢門類在各種廢水生物處理系統(tǒng)中也被報道，如焦化廢水、寵物食品工業(yè)廢水、制藥和煉油廠廢水等。同一時期不同粒徑的污泥因其結(jié)構(gòu)不同，微生物群落存在差異。D3、D4為同一時期不同粒徑的污泥樣本，兩樣本間的微生物存在細(xì)微差異。較明顯的是綠彎菌門（Chloroflexi）在D3時期出現(xiàn)（占0.02%），然而在D4中又消失不見，說明此菌門存在于120d時的小粒徑（0.45~2mm）污泥中。另外，厚壁菌門（Firmicutes）在D3中的含量為0.11%，在D4中的含量為0.52%。

從圖6還可以看出，污泥中的微生物菌群也發(fā)生著變化。疣微菌門（Verrucomicrobia）從D1時期的1.49%上升到D3時期的3.09%，F(xiàn)irmicutes由4.3%降到了0.11%。同時期裝甲菌門（Armatimonadetes）的變化也較大，由0.68%下降到0.03%。在此期間，污泥濃度也是在不斷變化的，Verrucomicrobia的增多是由于污泥濃度增大引起的。同時，系統(tǒng)對NH4+-N和PO43--P的去除率也在逐漸升高，這說明Firmicutes和Armatimonadetes的減少對NH4+-N和PO43--P的去除有一定的積極作用，這是微生物群落演替的結(jié)果。

值得一提的是，浮霉菌門（Planctomycetes）的占比在D1~D4時期持續(xù)上升。而Planctomycetes的浮霉菌屬（Planctomyces）和小梨形菌屬（Pirellula）等都屬于專性好氧菌。與此同時，在Planctomycetes中還存在一類和Planctomyces等關(guān)系較遠(yuǎn)的細(xì)菌，由于暫時無法分離獲得純菌株，因此尚未能正式命名和分類（如CandidatusKuenenia、CandidatusScalindua、CandidatusBrocadia屬），它們能夠利用亞硝酸鹽在缺氧環(huán)境下氧化銨離子生成氮氣來獲得能量，因此稱作厭氧氨氧化菌。在該過程中，對NH4+-N的去除效果變好，說明該種菌對廢水中NH4+-N的去除做出了貢獻(xiàn)。這也顯示，該類細(xì)菌的富集將有助于短程硝化反硝化過程，對水生態(tài)環(huán)境的氮循環(huán)及番茄醬加工廢水的高效降解具有重要意義。

2.3.3 微生物群落在目水平上的差異

各樣品細(xì)菌在目水平上的分布情況如圖7所示?？梢钥闯觯t環(huán)菌目（Rhodocyclales）、鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）為主要菌目，兩菌目占比之和約為50%。伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）、黃桿菌目（Flavobacteriales）和嗜甲基菌目（Methylophilales）的變化較大。Burkholderiales在D3時期數(shù)量最多，而D3時期系統(tǒng)絮體污泥的占比較小，說明Burkholderiales在顆粒污泥中的量要多于在絮體污泥中的，這與已報道的Burkholderiales為番茄醬廢水的主要降解菌結(jié)論一致。Flavobacteriales的分布情況與Burkholderiales相反，其在D2中的占比要大于在D1和D3中的，更容易存在于絮體污泥中。Methylophilales的分布情況與Burkholderiales類似，其在顆粒污泥中的占比大于在絮體污泥中的。

從圖7還可以看出，一些細(xì)菌在生長過程中被淘汰了，同時伴隨一部分新的菌目出現(xiàn)。如梭菌目（Clostridiales）存在于D1和D2樣品中，而在D3樣品中消失。再如紅細(xì)菌目（Rhodobacterales）在D1與D2中的數(shù)量明顯高于在D3與D4中的?？梢姡煌瑫r期不同菌群表現(xiàn)出的協(xié)同或者競爭關(guān)系，即微生物群落的演替是活性污泥微生物有效降解有機(jī)物的驅(qū)動力，對反應(yīng)體系的穩(wěn)定性具有重要作用。

3、結(jié)論

①恢復(fù)初期顆粒污泥最大膨脹到11mm并出現(xiàn)破裂解體現(xiàn)象，13d后顆粒污泥開始穩(wěn)定恢復(fù)活性，到第20天時，部分存在空洞，出水水質(zhì)變清澈，逐漸恢復(fù)了AGS性能。第35天以后，空洞的顆粒污泥解體、消失，密實的橢球污泥形成，已經(jīng)完全恢復(fù)了AGS的良好性質(zhì)，標(biāo)志著顆?；瓿?。最終，第130天時，0.45~4mm的粒徑占比超過75%，占主導(dǎo)地位，MLSS穩(wěn)定在8000mg/L左右。

②恢復(fù)再生后的顆粒污泥對COD、NH4+-N和PO43--P的平均去除率分別在95%、82%和80%以上。高通量測序結(jié)果顯示，不同時期菌群的多樣性不斷變化，物種的均勻性逐漸上升。在門水平上，變形菌門和擬桿菌門之和占到總污泥菌群80%以上，是優(yōu)勢菌群。浮霉菌門的占比在D1~D4時期持續(xù)上升，它的屬中有一類細(xì)菌稱作厭氧氨氧化菌，對氮循環(huán)及番茄醬加工廢水的高效降解具有重要意義。在目水平上差異明顯，紅環(huán)菌目和鞘脂桿菌目是處理番茄醬廢水的主要菌目。伯克霍爾德氏菌目在顆粒污泥中的分布要多于絮體污泥，也是番茄醬廢水的主要降解菌。